Чому ПЛР-тест може не показати COVID-19?

Тести полімеразної ланцюгової реакції наразі вважаються найефективнішим методом виявлення коронавірусної інфекції. 

Наразі в Україні проводять близько 40 тисяч ПЛР-тестів на добу, а до кінця року цей показник має вирости до 75 тисяч, пише УП.Життя.

Проте є випадки, коли пацієнти скаржаться на симптоми притаманні коронавірусу, але отримують негативні результати ПЛР-тесту.

Раніше головний санітарний лікар Віктор Ляшко в інтерв’ю “Українській правді. Життя” розповів, що таке тестування показує правильний результат у 70% випадках. 

Міністр охорони Максим Степанов уточнював, що третина тестувань проведених методом-ПЛР може бути хибною через низку причин: “Це пов’язано із забором матеріалу, фізіологічними особливостями організму, з тим, де саме розташовується вірус в той час, коли беруть мазок для діагностики ПЛР”.

То які фактори впливають на достовірність ПЛР-тесту, та в яких випадках можна отримати хибний результат? 

Відповідь на ці питання в рамках проекту “Запитай Життя” нам допомагали знаходити:

Біжан Шаропов, головний біолог “Українські генетичні технології”, один з розробників українських тест-систем; 

Олена Лівінська, біологиня, засновниця науково-популярного ресурсу “Мікроб і я”.

Нагадаємо, у форматі AMA (ask me anything) ви можете поставити нам будь-яке запитання і ми знайдемо експерта, який на нього відповість.

Наприклад, ми вже пояснювали: 

• Втрата нюху та смаку: чому цей симптом став №1 при COVID-19 та що з цим робити?
• Як відновити організм після хвороби та надміру ліків?
• Куди поділися горобці?

Як працює ПЛР-тест?

“ПЛР-діагностика заснована на проведенні полімеразно-ланцюгової реакції – це багаторазове копіювання конкретного фрагменту ДНК.

Якщо досліджуваний фрагмент ДНК або РНК присутній у клінічному матеріалі, то реакція запускається, якщо відсутній – не запускається”, – розповідає біологиня Олена Лівінська. 

Олена Лівінська

Унікальність цього методу в тому, що він дозволяє з великої кількості генетичних послідовностей виділити потрібну та дослідити її. 

“ПЛР-тест працює таким чином, що виявляє безпосередньо генетичні послідовності вірусу в мазку зі слизових оболонок.

Якщо просто взяти мазок з носа, то там буде величезна сума найрізноманітніших мікроорганізмів. Також при заборі забирається і власна ДНК пацієнта. 

Метод ПЛР дозволяє з цієї мішанини генетичних послідовностей вибрати одну, розмножити її і зафіксувати”, – пояснює Біжан Шаропов. 

Проведення аналізу проходить у кілька циклів. 

“Циклами відбувається розмноження ДНК, зазвичай, їх 40. Якщо людина сильно хвора, то порогове значення появиться на 23-25-му циклі”, – пояснює науковець.

Біжан Шаропов

Як підготуватися до забору матеріалу для ПЛР-тесту

Біологія Олена Лівінська зауважує, що якісь фізіологічні особливості людини не мають сильного впливу на результат тестування.

Але радить утриматися від деяких процедур, щоб зберегти кількість вірусу на час тестування.

“Перед здачею тесту бажано не їсти, не пити, не промивати ніс чи рот, аби було більше вірусного матеріалу, якщо він присутній”, – зауважує науковиця. 

Крім того, експертка зауважила, що лабораторія може надавати власні рекомендації, опираючись на можливі особливості роботи тестів, з якими вони працюють. 

У Центрі громадського здоров’я зазначають, що перед проходженням ПЛР-тестування пацієнту не рекомендується:

За 6 годин

• Вживати лікарські засоби для зрошення ротоглотки;
• Використовувати препарати для розсмоктування. 

За 3-4 години

• Жувати гумку чи цукерки;
• Чистити зуби, полоскати горло чи рот;
• Їсти чи пити;
• Курити. 

Здавати тестування у ЦГЗ також рекомендують уранці – одразу після нічного сну. 

Олена Лівінська пояснює, це через те, що їжа та напої можуть впливати на результат.

Як має проводитися процедура забору матеріалу для ПЛР-тесту 

Відбирати матеріал для досліджень можуть лише медичні працівники, або представники мобільних бригад. 

У ЦГЗ створили інструкцію для медичних працівників, як саме вони повинні проводити цю процедуру. 

При цьому як пацієнт ви можете пересвідчитися в наявності необхідних засобів захисту та оцінити наскільки професійно у вас взяли мазок. 

Отже, медпрацівники під час забору мають використовувати такі засоби захисту:

✅ медична маска або респіратор класу захисту не нижче ніж FFP2;

✅ захисні окуляри або щиток для обличчя;

✅ ізоляційний захисний халат та шапочка;

✅ рукавички. 

Для відбору біологічного матеріалу повинні бути наявні:

✔ стерильні тампони з дакрону чи віскози або універсальні зонди;

✔ шпатель;

✔ транспортний епендорф із середовищем;

✔ інструмент для маркування біологічного матеріалу;

✔направлення на лабораторне тестування;

✔ пакети для направлення та контейнеру з біологічним матеріалом.https://www.youtube.com/embed/efHKM9lZvKY

Як правильно береться мазок:

Для того, щоб взяти мазок із горла потрібно повільним рухом зробити мазок із задньої стінки глотки та мигдаликів. Тампон або зонд не має торкатися мягкого піднебіння.

Для того, щоб взяти мазок із носа, потрібно ввести тампон або зонд у ніздрю на 2-3 см, торкаючись середньої носової раковини і слизової оболонки перегородки. Зразки з обох ніздрів беруться одним тампоном. 

Для мазків із зіва та носа повинні використовуватися окремі тампони або зонди.

Після забору потрібно помістити тампон оба зонд в стерильну пробірку з 2-3 мл транспортного середовища разом із мазком із зіва. Прокрутити його до 10 разів, а після – утилізувати.

Також необхідно промаркувати зразок. Медпрацівник повинен зазначити на контейнері індивідуальний номер, дату відбору та тип зразка. 

Важливим заключним етапом проведення забору є своєчасне транспортування зразків до лабораторії для проведення аналізу. 

Коли тест вважається негативним

Важливо розуміти, що достовірність тієї третини досліджень, які за статистикою показують неправильний результат – це не похибка тесту. 

У 30% випадків тест показує негативно хибний або позитивно хибний результат, через вплив різноманітних факторів. Наприклад, це може залежати від неправильного забору або транспортування матеріалу. 

При цьому достовірність самого методу складає 96-99%. 

“Будь-який молекулярно біологічний метод: ІФА, ПЛР, навіть МРТ –  завжди пов’язаний з помилками. 

В медицині золотим стандартом вважається, що метод, який має відсоток істинно позитивних, або істинно негативних результатів від 95% до 99%.  

Нашу тест-систему ми випробовували на такі параметри як специфічність і чутливість.  

Заміри показали 96% чутливості  і 99% специфічності”, – пояснює Біжан Шаропов. 

Тести на коронавірус: як їх роблять, за яких умов і чи можна зробити самостійно

Він пояснює, що при ПЛР-тесті відбуваються два процеси: 

Ампліфікація – розмноження якоїсь послідовності, коли з двох молекул може утворитися 2 мільярди. 

Детекція – коли флуоресцентна мітка, яка плаває в пробірці, зв’язується строго з протрібною послідовністю інтересу. 

“Результат називається негативним, коли в зразку не було послідовності інтересу і ампліфікація не відбулася. 

Це все визначається в спеціальному приладі під назвою термоциклер.Зазвичай, туди завантажують 96 зразків.  

Реакція відбувається в пробірці, а цей прилад детектує відсвічування пробірки та малює на екрані криву.  

Якщо зразок негативний – крива вийде рівною. Якщо зразок позитивний, то відбувається розмноження ДНК, відповідно, крива зростає”, – пояснює експерт. 

Що впливає на достовірність ПЛР-тесту 

Розташування вірусу

Раніше у МОЗ розповідали, що результат ПЛР-тесту може бути хибно негативним, коли вірус розташовується не в ротоглотці, а нижніх частинах дихальних шляхів. 

Науковець Біжан Шаропов зазначає, що така ймовірність є, проте вірусологи досі сперечаються стосовно цього питання. 

“Коронавірус більш тропний до епітелію нижніх дихальних шляхів. 

Тому є теорія, що при захворюванні він може дійсно в основному розмножуватися десь глибоко у бронхах та легенях – а на горі його буде мало, тому виявити буде важко.

Але є і протилежна теорія – що цей вірус настільки активно розмножується, що його навіть виявляють в сечі та калі. 

Під час розробки тест-системи, ми дуже дивувалися, коли ознайомлювалися з документами китайських вчених та Всесвітньої організації охорони здоров’я, де сеча і кал проходили як дозволений матеріал для діагностики коронавірусу”, – розповідає вчений. 

Олена Лівінська додає, що справді можуть бути такі нюанси, але в такому випадку наявність вірусу можна перевірити іншим методом.

“Бувають випадки клінічної картини пневмоній із відповідним КТ, а ПЛР з верхніх дихальних шляхів негативний.

У такому випадку може проводитися забір зразків із нижніх дихальних шляхів, або використання імунних методів діагностики.

Матеріал із верхніх дихальних шляхів найбільш інформативний в перший тиждень від настання перших симптомів”, – зазначає біологиня. 

Процес забору матеріалу

Забір матеріалу – один із найважливіших чинників, від якого залежить достовірність результату. Він повинен проводитися з дотриманням всіх санітарних вимог.

Наприклад, є випадки, коли під час забору пацієнтам пошкоджують слизову оболонку, через що на мазку залишається кров. 

Експертка Олена Лівінська зазначає, що це також може вплинути на визначення результату.

“Якщо у зразку буде присутня кров, то із такого зразка може бути трохи важче виділити нуклеїнові кислоти. Але це більше стосується експрес-методик. 

Якщо ж проводяться повністю всі необхідні етапи підготовки зразків до діагностики, то такого бути не повинно”, – розповідає вона. 

Життєздатність вірусу 

Мова йде про життєздатність вірусу, який залишається на мазку під час забору.

Бувають випадки, коли пацієнти чекають результу свого тесту зо 5 днів, або й більше тижня. 

При цьому життєздатність вірусу на тампоні обо зонді є достатньо низькою, тому без спеціальних умов він може просто не дочекатися дослідження. 

В такому випадку пацієнт ризикує отримати хибно негативний результат. 

“Віруси – це не повноцінні організми, які складаються з кількох молекул і живуть за допомогою партнерів. 

Вони не здатні довго підтримувати свою життєздатність.

В суху теплу погоду вірус живе на поверхні 15 хвилин. Якщо вірус забрати в розчин – він теж руйнується, але з меншою швидкістю. 

При кімнатній температурі вірус руйнується з добу-дві”, – пояснює Біжан Шаропов. 

Фото fotoquique/Depositphotos

У Центрі громадського здоров’я МОЗ зазначають, що максимальний термін зберігання назофарингіальних зразків при температурі 4°C– не більше 5 діб. 

В ідеальному випадку всі мазки з дихальних шляхів варто транспортувати в лабораторію протягом 24-48 годин з моменту взяття. 

Якщо це зробити неможливо, то зразки потрібно заморозити при температурі –70°C.

При цьому кількість циклів заморожування та розморожування має бути мінімальною, оскільки це може зруйнувати вірус у зразку. 

Транспортування заборів 

Ще одним важливим фактором, який власне не дозволяє вірусу втратити свою життєдіяльність до проведення аналізу, є правильне транспортування зразків у лабораторію. 

“На нуклеїнові кислоти вірусу можуть впливати ферменти, які можуть бути присутні в самому зразку. 

Тому зразки поміщуються у спеціальне транспортне середовище, яке нівелює дію цих ферментів”, – розповідає Олена Лівінська. 

Що таке транспортні середовища і чому вони важливі, пояснює Біжан Шаропов:

“Транспортні середовища – суміш, яка одразу руйнує, розкладає вірус – а з іншого боку захищає його нуклеїнову кислоту від руйнування. 

У такому транспортному середовищі вірус може прожити близько місяця. 

Є ще транспортні середовища, які є протекторними щодо вірусу – тобто не руйнують і зберігають його, а навпаки повністю стабілізують”, – пояснює експерт. 

За його словами, недостача транспортних середовищ створювала велику проблему на початку епідемії в Україні. 

“Я впевнений, що дуже багато пацієнтів було пропущено саме через те, що не було ще налагоджено виробництва транспортних середовищ у нас в Україні. 

Тоді віруси возили просто в фізіологічному розчині.

І багато хибно негативних результатів було отримано саме через руйнування вірусу в зразку, поки він виїжджав з регіональних медзакладів до лабораторій. 

Зараз ситуація виправилась, вже є достатньо транспортних середовищ”,– розповідає науковець.

Експерт також зауважує, якщо мазок з вірусом не знаходиться в транспортному середовищі, то єдиний спосіб його “врятувати” – заморозити.  

При цьому є спосіб, який дозволяє перевірити цілісність забору, який приїхав до лабораторії – вони проходять спеціальний контроль. 

“Для того, щоб зрозуміти, що зразок нормально доїхав з лікарні в лабораторію, є таке поняття як внутрішній контроль.

Окрім розмноження та детекції вірусної частинки, тест-система передбачає  розмноження виявлення геному ДНК пацієнта.

Якщо зразок був погано забраний, або зруйнувався по дорозі, то буде негативний результат по самому вірусу, а також по людському геному. 

Це означає, що в заборі було все зруйновано. Всі сучасні тест-системи включають такий внутрішній контроль”, – пояснює Шаропов. 

При цьому зазначає, що про негативний результат лабораторія має право говорити тільки тоді, коли у неї немає розмноження РНК-вірусу, але є розмноження людської РНК. 

Тобто спрацював внутрішній контроль. 

Наявність “мертвого” вірусу

Окрім хибно негативного результату тесту під час ПЛР-тесту можна також отримати хибно позитивний результат. 

Це явище менш поширене, проте може трапитися, якщо в організмі залишилися фрагменти мертвого вірусу від інфекції, яка минула.

“В принципі така ймовірність може бути, – аналізує ситуацію Біжан Шаропов.

Але один фрагмент вірусу аналіз не виявить, тому що “золотим стандартом” є детекція від 10 копій. 

Тобто реакція відбудеться, якщо на мазку буде більше 10 вірусів”. 

Експерт зауважує, що в науковому світі досі триває дискусія щодо так званих низькокопійних зразків. 

“Якщо людина серйозно хвора, то під час забору на маску залишається тисяча молекул вірусу. 

Це означає, що крива під час аналізу виросте на ранніх циклах. 

При цьому великою проблемою досі залишаються пацієнти, в яких ПЛР виявляє присутність вірусу на 38-39 циклі. 

Тоді не зрозуміло, чи вони одужують,чи лише трішки заразилися, а імунна система  може сама впоратися на ранніх стадіях”, – пояснює науковець.

Один із авторів дослідження про хибно позитивні тести, професорКарл Генега зауважує, що неможливо перевірити кожен тест на наявність активного вірусу, але ймовірність хибно позитивних результатів можна зменшити, якщо вчені можуть визначити граничну межу.

Наразі результати ПЛР-тесту приходять у якісному значенні – “виявлено/не виявлено”.

Ми розпитали в нашого експерта наскільки важливе кількісне значення, як при ІФА-тесті, та чи можливо його наразі отримати. 

“Зараз не прийнято аналізувати ці дані, лабораторія видає тільки один результат. 

Але з власного досвіду мені здається, що кількісне значення ПЛР-тесту – важливе. 

Пацієнти у яких в зразку виявляється мала кількість копій вірусу, принаймні за моїм досвідом, набагато менш заразні, якщо заразні взагалі. Вони мають мале вірусне навантаження.

Мені здається, що на це потрібні додаткові дослідження – варто було б розвиватися в той бік”, – ділиться думками один з розробників тест-систем в Україні. 

Період захворювання

Такий метод тестування може визначити наявність вірусу на ранніх етапах інфікування. 

Тобто для проведення ПЛР-тестування потрібно чекати якогось етапу захворювання.

“ПЛР дозволяє вже за кілька годин після того, як вірус почав розмножуватися в тканинах, детектувати його наявність. 

Навіть до того як почалися самі симптоми”, – зазначає Біжан Шаропов. 

Пр цьому в МОЗ зазначають, що зразки з верхніх і нижніх дихальних шляхів, зібрані в перші дні після появи симптомів, мають більшу діагностичну цінність при виявленні вірусу методом ПЛР. 

ПЛР-тестування є більш оперативним способом визначити вірус, ніж тести імуноферментного аналізу, які визначають наявність антитіл. 

“ПЛР-тести вважають способом, який швидше реагує. 

Бо для того, щоб як слід прокинулась імунна відповідь на будь-яку інфекцію, потрібно кілька днів. 

За цей час вірус може спокійно розмножуватися, після того організм накопичує достатню кількість антитіл. 

Тому ІФА спрацьовує тільки через кілька днів, після того як інфекція уже почалась. 

Його недоліком, саме в епідеміологічному аспекті є те, що людина – кілька днів заразна”, – пояснює головний біолог. Дарія Поперечна, УП. Життя • Більше ексклюзивних новин читай у газеті ЯСНО • Купи газету в кіоску або передплати на своїй пошті • Індекси 76076, 76300 • ЯСНО – газета #1 для життя! ЗакарпатПост